异种肌腱修复肌腱缺损微观实验：验证可作为临床肌腱修复的生长支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体肌腱修复肌腱缺损因可用肌腱有限且形成供区功能障碍，同种异体肌腱同样来源有限，并且价格昂贵，在临床上很难满足其需要。

目的：观察不同时期异种肌腱修复肌腱缺损的微观变化，为异种肌腱作为临床组织工程化肌腱生长支架提供理论依据。

方法：取6月龄的Leghorn鸡屈趾肌腱经化学去细胞处理后作为异种肌腱移植供体，健康成熟日本大耳白兔36只，建立双后肢跟腱中间束2 cm缺损模型，随机分为异种肌腱移植组和自体肌腱移植组，每组18只。肌腱移植缝合用4-0无创伤肌腱缝合线行双“8”字缝合，移植后伸直位管型石膏固定2周，对供体肌腱行去细胞前后大体观察、生物力学测定、组织学光镜及电镜观察，术后2，4，9周每组取6只兔对标本行组织学光镜及电镜检测。

结果与结论：①肌腱经过化学去细胞处理后色泽变白，质地较前柔软，去细胞前可见细胞与胶原纤维交替紧密排列，去细胞后胶原排列相对松散，且无细胞及细胞碎片，去细胞后肌腱的力学强度较术前减弱。②由电镜图片直观看到：随移植时间的延长，移植的粗大鸡肌腱胶原纤维逐渐被再生的兔肌腱胶原纤维最终替代，而新生成的纤细胶原纤维经改造塑形变为粗细相等的较粗大纤维，排列方向逐渐趋于平行，在结构和功能上达到正常肌腱水平。结果表明，去细胞后的最大抗拉力是去细胞前的83.44%，能够满足肌腱移植生物力学的要求。最终肌腱修复是再生胶原纤维形成的结果，异种肌腱经过理化方法处理后可作为临床肌腱修复的生长支架使用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 去细胞, 异种肌腱, 组织工程, 肌腱修复, 生物力学

Abstract:

BACKGROUND: Autologous tendons for repair of tendon defects are limited due to the supply of available and can induce tendon dysfunction. Limited sources and high cost of tendon allograft are also difficult to meet the clinical needs.

OBJECTIVE: To provide n theoretical basis for xenogeneic tendon as a clinical tissue-engineered tendon scaffold by observing microscopic changes of xenogeneic tendon in repair of tendon defects at different periods.

METHODS: Flexor tendons from Leghorn chickens (6 months old) were treated chemically as xenogeneic tendon donors. Thirty-six Japanese white rabbits were used to make 2 cm defect models of the intermediate beam in the Achilles tendon of bilateral hind limbs and then divided into two groups randomly, 18 in each group. The experimental group was treated with acellular xenogeneic tendon transplantation and the control group was treated with autologous tendon transplantation. Tendon suture was done using 4-0 non-invasive tendon suture line in double “8” way and the grafts were straightened and immobilized by plaster for 2 weeks. The donor tendons were conducted by general observation, biomechanical test, and engineering observation by optical and electron microscope before and after decellularization. At 2, 4, 9 weeks after transplantation, six rabbits in each group were evaluated by means of optical and electron microscope observation.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The color of tendon cells treated chemically became white and the texture was softer than that before decellularization. The cells and collagen fibers arranged closely and alternately before decellularization, but the arrangement of the collagen fibers was loose relatively and there were no cells and cell debris after decellularization. Moreover, the mechanical strength of the acellular tendon was reduced than that before decellularization. (2) Electron microscope observation: With the increase of transplantation time, the collagen fibers of the transplanted thick chicken tendons were gradually replaced by the ones of the regenerated rabbit tendons. The newly generated collagen fibers were transferred to same-thickness fibers and arrange parallelly, and their structure and function were close to the normal tendons. The maximum tensile resistance after decellularization was 83.44% as before, which could meet the needs of tendon mechanical strength. Ultimately tendon repair is the result of the collagen fiber regeneration, and the xenogeneic tendon treated by chemical methods can be used as the growth scaffold for clinical tendon repair.

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Key words: Tendons, Transplantation, Heterologous, Biomechanics

中图分类号:

R318

聂继平，温树正，白志刚. 异种肌腱修复肌腱缺损微观实验：验证可作为临床肌腱修复的生长支架[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1184-1189.

Nie Ji-ping, Wen Shu-zheng, Bai Zhi-gang. A micro-experimental study on tendon defect rapair with xenogeneic tendon as a growth scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1184-1189.

图/表（结果） 3

2.1 肌腱去细胞前后肌腱大体观察 未去细胞的肌腱呈黄白色或淡白色，腱膜完整，表面光泽较弱，质地较硬；去细胞肌腱呈瓷白色，腱膜完整，表面光泽较强，质地柔软、韧性好。

2.2 供体肌腱去细胞前后生物力学测定结果 肌腱经脱细胞处理后，其力学强度有一定降低，去细胞前与去细胞后对比有显著性意义[(116.98±23.36)，(97.61±11.38) N，t=2.36，P=0.030]；去细胞后肌腱最大抗拉力是去细胞前的83.44%，能满足肌腱移植的生物力学要求。

2.3 供体肌腱去细胞前后光镜及电镜检测结果 苏木精-伊红染色光镜100倍下见去细胞前胶原纤维平行紧密排列，束间可见细胞呈串平行排列(见图1A)；去细胞后胶原纤维结构松散，呈波浪状排列，纤维束间无细胞及细胞碎片残留(见图1B)。

去细胞前电镜下见粗大的胶原纤维平行排列、结构致密，可见明显周期横纹，细胞核呈梭形、不规则形，细胞器很不发达，数量少，界限不清；去细胞后粗大的胶原纤维结构变的松散，走行基本一致，仍可见周期横纹，但无细胞及细胞碎片残留(见图2)。

2.4 移植后2，4，9周组织学光镜观察结果 天狼星红对胶原纤维染色具有其与胶原分子吸附紧密，反应稳定，染色后不褪色且具有特异性，是目前胶原染色的最佳染料。染色后在偏振光显微镜下可见Ⅰ、Ⅲ型胶原显示不同的颜色，Ⅰ型胶原为鲜红色或橙黄色较粗的纤维，成强双折光；Ⅲ型胶原为绿色较细的纤维，呈弱双折光，对比鲜明，极易区别。移植后2周时，两组胶原纤维染色都以Ⅲ型胶原为主，以绿色纤维为主，红色纤维散在其间(见图3A，B)；移植后9周时，两组胶原都较成熟，以Ⅰ型胶原纤维为主，染色呈红色，绿色纤维很少，接近正常兔纤维染色(见图3E，F，G)。移植后4周处于2周与9周的过渡期，红绿纤维交替排列较为明显，但以红色为主(见图3C，D)。

2.5 移植后2，4，9周组织学电镜观察结果

移植后2周：异种肌腱移植组见未被替代的粗大鸡纤维与新生细小兔纤维交错排列，新生纤维呈短节状，不连续，排列稀疏，靠近细胞处新生兔纤维较多，可见未被替代完全的粗大鸡纤维阴影，细胞核大，呈椭圆形，细胞器发达，呈球囊状扩张(见图4A-C)；自体肌腱移植组见胶原纤维纤细，排列稀疏，细胞核大，细胞器发达，呈球囊状扩张(见图4D，E；以上结果提示，2周时两组都处于肌腱修复的早期。

移植后4周：异种肌腱移植组见新生兔胶原纤维较2周时增粗，排列整齐有序，可见残存的粗大鸡纤维，细胞核呈长椭圆形，胞质少，细胞器不发达，胞质内可见其模糊轮廓(见图4F，G)；自体肌腱移植组见胶原纤维较2周时增粗，纤维数量较多，排列整齐有序，细胞核及细胞器形态同异种肌腱移植组相似(见图4H，I)。

移植后9周：异种肌腱移植组见新生兔胶原纤维经改造塑形后变得更加粗大，致密有序排列，可见明显周期横纹，偶而模糊可见残存鸡纤维替代阴影，细胞核呈长梭形，细胞器极不发达，模糊不清(见图4J，K)；自体肌腱移植组见胶原纤维粗大致密，整齐有序排列，横纹明显，细胞核呈长梭形，细胞器极不发达，模糊不清(见图4L，M)；以上结果显示，9周时两组基本都处于肌腱修复的晚期。

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引言

肌腱损伤是手外科医生在临床工作中经常遇见的问题，而肌腱缺损约占肌腱损伤的1/4，肌腱的连续完整性是维持手指活动功能的基础，否则就是一只无用的手，在临床中经常见到虽然保留了患肢，但因肌腱没能及时修复而不能活动的情况，患者非常痛苦。这些患者中经常因修复材料有限或价格昂贵而放弃治疗，最终对家庭以及社会带来沉重的负担。

目前肌腱修复方法大致分为4类，第1类也是金标准：自体肌腱移植，对于缺损较小的可以完全满足，但对于损伤较大缺损较多的患者，往往因自体肌腱移植供体有限，且造成供区功能障碍等弊端，往往不能满足临床工作的需要；第2类是同种异体肌腱移植，目前在临床上应用比较广泛，在大型医院开展较好，可以满足部分富裕阶层，同种异体肌腱给人们带来希望的同时，但其价格昂贵并且来源也有限等问题，在临床上很难推广应用^[1]，肌腱受损的患者往往是基层的劳动人民，他们的经济条件有限，大多因此而放弃治疗，导致其残疾；第3类为人工肌腱，包括碳纤维、尼龙、涤纶、聚酯纤维等，其主要因存在体内长期不能腱化、粘连、不能吸收、异物反应等缺点，在临床上受到限制；第4类为组织工程化肌腱，其主要原理是提供一个能满足肌腱力学性能的细胞生长支架，在体外或体内植入种子细胞，通过调控形成肌腱样组织，从而使肌腱缺损得意修复，但此方法要求技术难度较大，成本昂贵，基本处于实验间段。因此，寻求一种既能满足临床需要又能使大多数患者受益的肌腱修复方法，是每个手外科医师一直努力的方向。

目前，大多学者认为肌腱移植的主要作用是提供一个“生长支架”^[2]，在体内引导周围组织细胞长入，通过细胞的增殖、分化、分泌及胶原的塑形等一系列变化，从而使肌腱得以修复。Deeken等^[3]在他的研究中提到经脱细胞处理的肌腱可明显降低其免疫原性，并且其具有天然的肌腱生长支架，与其他肌腱组织工程支架相比，更有利于肌腱的修复。作者通过建立动物实验模型，从微观角度来观察经化学方法去细胞异种肌腱修复肌腱缺损的效果，从而为肌腱修复提供一种可以普及的新方法。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2008年1至5月在内蒙古医科大学中心实验室完成。

材料：

实验动物：相同月龄(6个月)成熟莱亨鸡5只，切取其屈趾肌腱作为肌腱移植供体；健康日本大耳白兔36只，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，实验动物由内蒙古农业大学动物中心提供。

实验方法：

实验动物及分组：健康日本大耳白兔36只，随机分为2组，异种肌腱移植组为去细胞异种肌腱移植组(异种肌腱移植组)、自体肌腱移植组做对照。每组18只，分笼喂养。

供体肌腱的切取：将鸡处死后，切取双足屈趾肌腱，选取与兔跟腱中间束粗细一致的作为肌腱移植用。做肌腱移植的切取长度为2 cm，做去细胞前后生物力学测定的切取长度约5 cm。

脱细胞肌腱的制备^[4-5]：将切取好的莱亨鸡肌腱置于0.5%的胰蛋白酶溶液中，37 ℃持续晃动消化6 h(转速为150 r/min)，蒸馏水冲洗2次，再用0.5%的TritonX-100溶液在水浴恒温震荡器中浸泡并持续震荡48 h以去除细胞成分(转速为150 r/min)，然后将肌腱置于37 ℃超声波清洗机中用蒸馏水震荡漂洗2 h×3，体积分数75%的乙醇浸泡 30 min，磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2-7.6)振荡充分漂洗后，放在磷酸盐缓冲溶液中4 ℃冰箱保存。

兔跟腱缺损模型的制备：术前手术室用紫外线灯照射消毒，用10%的硫化钠行兔双后肢术区脱毛处理。称质量后，用麻药速眠新按0.1 mL/kg剂量由耳缘静脉麻醉，俯卧位后肢伸直位固定于手术板上，常规碘伏消毒后铺单，手术取后正中切口，切开皮肤、浅筋膜显露跟腱(注意保护周围血管)，游离跟腱三束中的中间束，横行切断造成2 cm的缺损，按实验分组取等长制备好的肌腱用4-0无创伤肌腱缝合线行双“8”字端端吻合(移植前用青霉素液和庆大霉素液各浸泡10 min)，5-0单丝线缝合腱鞘，缝合皮肤。自体肌腱移植组行左右肌腱对调后缝合。术后用管型石膏固定足趾于背伸位2周。

主要观察指标：

供体肌腱去细胞前后行大体观察、组织学光镜检测、组织学电镜检测及最大生物力学强度测定：在室温条件下，用去细胞前后肌腱各10个样本做生物力学检测，测定肌腱的最大断裂强度，测定前将肌腱两端各1.5 cm用湿纱布紧密包裹3层，再安装固定在测试机的金属夹具上开始测定，

夹具间肌腱长度统一为2 cm，拉伸速度为5 mm/min，直至肌腱完全断裂；切取去细胞前后肌腱各10个样本，组织固定、切片、染色后行组织学光镜及电镜观察。

兔肌腱组织学光镜和电镜观察：移植后定期(2，4，9周)每组处死6只兔，肌腱从两吻合口处切断，远端1/2修成1 mm×1 mm×2 mm组织块放入4%的戊二醛清洁玻璃瓶内固定后做组织学电镜30 000倍观察，近端1/2放入40 g/L的多聚甲醛清洁玻璃瓶内固定后行苦味酸-天狼星红染色组织学光镜100倍观察。

统计学分析：细胞前后生物力学测定实验所得数据以 x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计学软件进行两个独立样本的 t 检验，设检验水准α=0.05，认为P值 ≤ 0.05时差异有显著性意义。

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讨论

肌腱修复是临床中经常遇到的问题，目前，自体肌腱移植的因取材有限和供区功能障碍不能满足临床工作的需要，而其他修复手段也因诸多原因而没能在临床上普遍应用。因此，探索一种既能满足临床普遍推广应用，又能让患者所能承受的材料是研究人员追求的目标。

3.1 肌腱移植的抗原性问题除自体肌腱移植以外，其他方法都存在免疫排斥的问题，怎样能降低免疫排斥反应，是近年来一直研究的热点。Omae等^[6]实验证明肌腱经脱细胞处理以后，可明显提高异种肌腱的组织相容性。左新成等^[7]用不同理化方法处理异种肌腱的动物实验表明，经理化方法处理后的异种肌腱与新鲜异种肌腱相比，可明显降低其排异反应，与受体肌腱结合紧密，移植成功。陈元良等^[8]用小鼠与新西兰白兔做异种肌腱基质材料生物相容性实验证明，经过脱细胞处理的肌腱无明显排斥反应发生，具有良好的组织相容性。况且，肌腱的作用主要起牵拉、连接骨骼，使其运动的作用，不同于器官移植，器官移植是功能性移植，出现排斥反应很可能导致移植失败，而肌腱移植的主要作用是提供一个“生长支架”^[4]，如同目前临床应用异体骨治疗骨缺损，最终骨的愈合是新骨再生替代的结果，而非植入异体骨本身。

本实验采用TritonX-100和胰蛋白酶(Trypsin)消化联合去细胞的方法^[4-5]，成功将鸡的屈肌腱细胞脱去，经光镜及透射电镜观察，无细胞及细胞碎片残留。经过2，4，9周组织学光镜天狼星红染色可以直观看到胶原纤维逐渐成熟的过程：早期以Ⅲ型胶原为主，显示以绿色为主，随时间的延长，胶原纤维逐渐成熟为红色，Ⅰ型胶原为主，异种肌腱移植组与自体肌腱移植组无明显区别；2，4，9周实验电镜图片观察，异种肌腱移植组中原粗大鸡肌腱胶原纤维中早期长入了细胞，同时有再生的纤细纤维存在，随时间的延长再生纤维逐渐增粗，排列上变得有序，晚期粗大的鸡肌腱纤维被再生胶原纤维替代，这与目前大多学者认为异体肌腱修复肌腱缺损的机制相一致：异体肌腱移植后的修复是肌腱经处理后，破坏其细胞成分，在肌腱基质内形成“空巢”，体内受体细胞滞入，在内源性细胞因子的作用下使滞入细胞增殖、分化，逐渐演变为成熟的腱细胞，使胶原合成增加，再经过改造塑形形成具有抗拉力的胶原纤维。

3.2 肌腱愈合与生物力学的关系在肌腱修复早期，移植材料应满足一定的生物力学要求是非常必要的^[9]，Hidek 等^[10]通过研究发现肌腱修复后施加周期性张力不仅可以减轻粘连，而且可以刺激细胞增殖分化。Chen等^[11]通过实验发现，在肌腱愈合中，保留张力的肌腱可促进细胞增殖加速，胶原合成增加，这说明肌腱愈合过程张力的存在对肌腱愈合是非常有利的。Forslund等^[12]发现在无应力状态下 8周后，细胞的数目和胶原的合成数量都明显降低，而在周期性张力状态下，仅4周后细胞的数目和胶原合成量都有明显增加。Skutek等^[13]认为，周期性张力可以提高各类生长因子的含量，从而促进细胞增值、分化和基质的形成。本实验显示，去细胞后肌腱的最大抗拉力较去细胞前有所降低，为去细胞前的83.44%，这样的强度可以满足肌腱移植的生物力学要求。

由于本实验异种肌腱移植组选用“替代肌腱”的胶原纤维粗细与再生肌腱胶原纤维的粗细存在超微差别，直观的显示了异种肌腱修复机制：去细胞异种肌腱总体上经历了受体细胞长入，新的胶原纤维再生、植入纤维被替代和新纤维再塑形的过程；早期滞入细胞(成纤维细胞或间充质干细胞)增生活跃，胞体和胞核较大，形态呈圆形或椭圆形，胶原合成增加，胶原纤维早期以纤细、短节状纤维为主，且排列较紊乱，随时间延长，粗细不等的胶原纤维经改造塑形变为粗细相等的较粗大纤维，排列方向趋向平行，在结构和功能上逐渐达到正常腱水平。同时，本实验通过检测两组移植前及移植后3，7，14 d外周血白细胞数的变化，间接了解免疫排斥反应的大小，经过统计学对比，两组无统计学差异，此相关内容发表在另一篇文章。因此，本实验证明异种肌腱经化学去细胞胞方法处理以后，可明显降低其免疫原性，并能满足肌腱移植早期生物力学要求，移植后无明显的排斥反应发生。其作为具有天然肌腱结构的“细胞生长支架”，具有潜在的应用价值，由于异种肌腱取材广泛，理化处理方法相对简单，费用相对便宜，便于在基层医院开展，因此有理由相信，异种肌腱移植材料将给肌腱缺损的修复手段带来新的希望。

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